A Universidade de Évora foi a segunda universidade a ser fundada em Portugal. Após a fundação da Universidade de Coimbra, em 1537, fez-se sentir a necessidade de uma outra universidade que servisse o sul do país.
Évora, metrópole eclesiástica e residência temporária da Corte, surgiu desde logo como a cidade mais indicada. Ainda que a ideia original de criação da segunda universidade do Reino, tenha pertencido a D. João III, coube ao Cardeal D. Henrique a sua concretização. Interessado nas questões de ensino, começou por fundar o Colégio do Espírito Santo, confiando-o à então recentemente fundada Companhia de Jesus. Ainda as obras do edifício decorriam e já o Cardeal solicitava de Roma a transformação do Colégio em Universidade plena. Com a anuência do Papa Paulo IV, expressa na bula Cum a nobis de Abril de 1559, foi criada a nova Universidade, com direito a leccionar todas as matérias, excepto a Medicina, o Direito Civil e a parte contenciosa do Direito Canónico.
A inauguração solene decorreu no dia 1 de Novembro desse mesmo ano. Ainda hoje, neste dia se comemora o aniversário da Universidade, com a cerimónia da abertura solene do ano académico.
As principais matérias ensinadas eram Filosofia, Moral, Escritura, Teologia Especulativa, Retórica, Gramática e Humanidades, o que insere plenamente esta Universidade no quadro tradicional contra-reformista das instituições católicas europeias do ensino superior, grande parte das quais, aliás, controladas pelos jesuítas.
No reinado de D. Pedro II, viria a ser introduzido o ensino das Matemáticas, abrangendo matérias tão variadas, como a Geografia, a Física, ou a Arquitectura Militar.
O prestígio da Universidade de Évora durante os dois séculos da sua primeira fase de existência confundiu-se com o prestígio e o valor científico dos seus docentes. A ela estiveram ligados nomes relevantes da cultura portuguesa e espanhola, dos quais importa ressaltar, em primeira linha, Luis de Molina, Teólogo e moralista de criatividade e renome europeu. Em Évora, foi doutorado um outro luminar da cultura ibérica desse tempo, o jesuíta Francisco Suárez, depois professor na Universidade de Coimbra. Aqui ensinou durante algum tempo Pedro da Fonseca, considerado o mais importante filósofo português quinhentista, célebre pelo esforço de renovação neo-escolástica do pensamento aristotélico.
Apesar das tentativas de modernização e abertura ao novo espírito científico, que caracterizam a Universidade setecentista, há que reconhecer, contudo, que, a exemplo da sua irmã mais velha de Coimbra, o seu esforço não se traduziu numa efectiva abertura dos espíritos às necessidades dos tempos novos. Não obstante o alto valor individual de numerosos docentes, o sistema de ensino como um todo, revelou-se desajustado e antiquado. Évora participou, assim, na tendência global de virar costas à Europa transpirenaica, que caracterizou a generalidade das elites e instituições culturais ibéricas do Antigo Regime.
Quando a conjuntura política e cultural de meados do século XVIII se começou a revelar hostil aos jesuítas, não admira que a Universidade de Évora se tenha facilmente transformado um alvo da política reformadora e centralista de Pombal. Em 8 de Fevereiro de 1759 - duzentos anos após a fundação - a Universidade foi cercada por tropas de cavalaria, em consequência do decreto de expulsão e banimento dos jesuítas. Após largo tempo de reclusão debaixo de armas, os mestres acabaram por ser levados para Lisboa, onde muitos foram encarcerados no tristemente célebre Forte da Junqueira. Outros foram sumariamente deportados para os Estados Pontifícios.
A partir da Segunda metade do século XIX, instalou-se no nobre edifício henriquino o Liceu de Évora, ao qual a rainha Dona Maria II concedeu a prerrogativa do uso de "capa e batina", em atenção à tradição universitária da cidade e do edifício.
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